Entre sus trabajos destacan las traducciones de los Parva Naturalia, De ortu et interitu, De mundo y, sobre todo, la Política de Aristóteles, publicada en París en 1548 con comentarios. Su método de traducción privilegiaba la claridad y la fidelidad conceptual frente al purismo estilístico ciceroniano, y sus versiones fueron muy valoradas por los estudiosos europeos, llegando a considerarse durante mucho tiempo una de las mejores traducciones latinas de la Política.
Además de su actividad filológica, Sepúlveda participó en diversos debates intelectuales y políticos de su época. En su Diálogo Democrates secundus defendió, apoyándose en la teoría aristotélica de la “esclavitud natural”, la legitimidad de la guerra y dominación española sobre los pueblos indígenas de América, a quienes consideraba culturalmente inferiores. Esta postura provocó una fuerte controversia con fray Bartolomé de las Casas y dio lugar al célebre debate de Valladolid (1550-1551). Aunque sus ideas sobre la conquista fueron muy discutidas y su obra no llegó a publicarse en vida, Sepúlveda siguió siendo reconocido como un destacado humanista y uno de los más influyentes traductores renacentistas de Aristóteles.